1.2.1 Conduite des tests
Comme nous l'avons indiqué la toxicité dépend de la voie d'exposition, de la dose et de la durée. Les tests (éco)toxicologiques ont donc pour objet de déterminer les effets et les doses caractéristiques (DL50, NOAEL ...) en fonction de ces variables.
Les tests doivent suivre des normes telles celles de l'International Standard Organisation (ISO) ou des lignes directrices et notamment celles de l'Organisation de Coopération et de Développement Economiques (OCDE). La liste des lignes directrices pour les essais écotoxicologiques et toxicologiques sont disponibles à :
• Section 2, Effets sur les systèmes biologiques : http://www.oecd-ilibrary.org/environment/lignes-directrices-de-l-ocde-pour-les-essais-de-produits-chimiques-section-2-effets-sur-les-systemes-biologiques_20745826
• Section 4, Effets sur la santé : http://www.oecd-ilibrary.org/environment/lignes-directrices-de-l-ocde-pour-les-essais-de-produits-chimiques-section-4-effets-sur-la-sante_20745842
Selon le principe que les effets sont proportionnels à la dose, ces essais consistent à exposer des organismes vivants à des doses croissantes de la substance à tester.
De manière très schématique, ces normes et lignes directrices fixent les conditions d'essais mais également les limites du test (dans le champ d'application).
Quatre exemples de tests sont résumés ci-dessous : deux sur les milieux aquatiques (milieux de transfert et milieu récepteur des pollutions) et deux sur les sols (milieu source de la pollution).
ISO 6341
Qualité de l'eau – Détermination de l'inhibition de la mobilité de Daphnia magna Straus – Essai de toxicité aiguë
Champs d'application :
Le test daphnie appliqué selon la norme ISO 6341 est applicable pour déterminer la toxicité aiguë vis-à-vis de Daphnia magna des substances chimiques solubles ou pouvant être maintenues en suspension ou en dispersion stable dans les conditions d'essai, des effluents industriels et urbains épurés ou non et des eaux de surface ou souterraines naturelles.
Principe :
Détermination de la concentration qui en 24h (ou 48h) immobilise 50% de Daphnia magna mises en expérimentation.
Cette concentration, dite concentration efficace inhibitrice, est désignée par CE50i-24h (ou CE50-48h).
Protocole de test :
Les tests doivent être réalisés en condition de lumière maîtrisée, soit en obscurité, soit sur un cycle jour/nuit de 16h/8h et à une température maintenue à 20°C±2°C.
Les daphnies utilisées pour l'essai doivent être âgées de moins de 24h et provenir d'un élevage aux conditions bien définies.
Les solutions testées (substances chimiques, effluents ou eaux naturelles) sont versées selon des volumes croissants dans une série de récipients et complétées avec une eau de dilution dont la composition est définie par la norme, de manière à obtenir les concentrations souhaitées pour l'essai.
Les daphnies sont placées, sans dépasser plus de 20 individus par récipient, ni 5 daphnies pour 10 ml de solution.
Les animaux ne sont pas nourris durant l'essai.
Après 24h (ou 48h), les daphnies encore mobiles sont dénombrées. Pour chaque concentration, un pourcentage d'immobilité est calculé. La CE50i-24h (ou CE50i-48h) est ensuite calculée par une méthode statistique appropriée.
NF T 90-375
Détermination de la toxicité chronique des eaux par inhibition de la croissance de l'algue d'eau douce Pseudokirchneriella subcapitata (Selenastrum capricornutum).
Champs d'application :
Le test algue est une méthode de détermination de la toxicité chronique applicable aux effluents aqueux industriels et urbains, aux lixiviats ou extraits aqueux ainsi qu'aux eaux douces de surface ou souterraines.
Principe et protocole :
Des algues de l'espèce Pseudokirchneriella subcapitata issues d'une culture en phase exponentielle de croissance sont placées dans chacune des concentrations de l'échantillon à examiner, en présence de milieu nutritif.
Les solutions d'essai ainsi constituées et les solutions témoins, maintenues en agitation, sont placées à température et sous illumination constante, pendant 72h.
Les concentrations cellulaires de chaque récipient sont déterminées toutes les 24h ou seulement à la fin de la période d'essai.
Les pourcentages d'inhibition de la croissance sont calculés par rapport aux solutions témoins réalisées dans les mêmes conditions.
Un tableau présentant ces pourcentages est établi et permet de tracer une droite correspondante : la courbe d'inhibition. La CE50 est déterminée graphiquement. Il s'agit de la concentration de la solution d'essai correspondante à un pourcentage d'inhibition de 50%.
NF ISO 11268-1
Qualité du sol : Effets des polluants vis-à-vis des vers de terre. Partie 1 : Détermination de la toxicité aiguë vis-à-vis de Eisenia fetida/Eisenia andrei
Champs d'application :
Ce test permet d'évaluer la fonction d'habitat des sols et de déterminer la toxicité aiguë de contaminants du sol et de produits chimiques pour Eisenia fetida/Eisenia andrei par absorption cutanée et ingestion.
Il s'applique aux sols et aux matériaux de type sol de qualité inconnue, provenant, par exemple, de sites contaminés, de sols amendés, de sols après remédiation, de sols agricoles ou autres sites d'intérêt et de déchets.
Principe et protocole :
Les échantillons à tester sont des sols prélevés sur un site industriel, agricole ou autre site d'intérêt, ou des déchets (par exemple matériau de dragage, boues provenant d'une station d'épuration des eaux urbaines, matériau composite ou fumier) pour lesquels une éventuelle mise en dépôt terrestre est envisagée. Ils sont séchés à l'air libre sans chauffage, tamisés à 4 mm et homogénéisés. Ils sont conservés sur la durée la plus courte possible et dans des conditions qui évitent la perte des contaminants (volatilisation et sorption sur les parois des récipients).
Avant les tests, il faut mesurer le pH, la texture, la teneur en eau, la capacité de rétention d'eau, la capacité d'échange cationique et le carbone organique.
Le témoin est soit un sol de référence soit sol standardisé (= sol artificiel). Le sol de référence provient de zones non contaminées voisines du sol étudié (c'est pratiquement impossible à trouver). Le sol artificiel est un mélange de Tourbe de sphaignes, d'argile kaolinique, de sable de quartz industriel et de carbonate de calcium pour obtenir un pH de 6,0 ± 0,5.
Les sols à testés et les sols artificiels sont mélangés de façon à obtenir différentes concentrations en sols à tester. Des aliquotes de 500 g (équivalent sec) sont préparés et introduits dans des béchers en verre. Le témoin est constitué de 100% de sol artificiel. Le pH de chaque échantillon est mesuré.
Des vers (espèce Eisenia fetida ou Eisenia andrei) de poids homogènes sont préparés, lavés et essuyés. 10 vers préalablement pesés sont placés dans chacun des béchers maintenus pendant 14 jours à 20 ± 2 °C et sous lumière (400 Ix à 800 Ix) selon un cycle de 12 h:12 h et 16 h:8 h.
À la fin de l'essai, le nombre total et la masse des vers vivants, la teneur en eau et le pH sont mesurés pour chaque concentration d'essai.
Les résultats obtenus sont utilisés pour déterminer les dilutions ou concentrations qui n'ont aucun effet sur la biomasse et la survie (NOEC) ou bien qui entraînent une mortalité de 50 % des vers de terre (CL50, 14 jours).
ISO 11269-2
Qualité du sol - Détermination des effets des polluants sur la flore du sol. Partie 2:
Effets des substances chimiques sur l'émergence et la croissance des végétaux supérieurs
Champs d'application :
Cet essai permet de déterminer des éventuels effets toxiques de substances chimiques solides ou liquides incorporées dans le sol sur l'émergence, les premières phases de croissance et le développement de toute une variété de végétaux terrestres. Il est également applicable à la comparaison des sols de qualité connue et inconnue.
Principe et protocole :
Les semences des espèces de végétaux sélectionnés sont plantées dans des pots contenant le sol auquel a été ajouté le produit chimique d'essai/le sol à tester et dans des pots témoins. Les pots sont conservés dans des conditions assurant la croissance des espèces sélectionnées pour l'essai. L'émergence et la masse des pousses des végétaux d'essai (sèche ou fraîche) sont comparées à celles des végétaux témoins.
Au moins deux espèces doivent être testées, l'une doit appartenir à la famille des monocotylédones et l'autre à celle des dicotylédones.
Avant les tests, il faut tamisés le sol à 4-5 mm et mesurer le pH et la teneur en carbone.
Le témoin est un sol de référence (le sol artificiel n'est pas recommandé pour cet essai).
Le sol à testés et le sol de référence sont mélangés de façon à obtenir différentes concentrations en sols à tester. Des aliquotes sont répartis dans des pots et la capacité de rétention d'eau est mesurée.
Les graines sont introduites et les pots sont placés dans des enceintes où la température, l'humidité et les conditions d'éclairage sont contrôllées (phytotron, serre).
Dès le phénomène d'émergence, le nombre de semis est réduit pour ne conserver qu'un total de cinq plantules. Après 14 jours à 21 jours, le nombre de végétaux qui émergent et la masse totale de pousses sont déterminés.
Calculer, pour chaque plante, le pourcentage d'émergence par rapport à l'émergence moyenne dans les pots témoins ainsi que le pourcentage pour la masse totale moyenne par rapport à celle chez les témoins.
Les résultats obtenus sont utilisés pour déterminer (1) la plus forte concentration qui n'a aucun effet sur l'émergence et la biomasse (NOEC) et (2) la plus faible concentration qui induit une réduction de croissance/d'émergence par rapport au témoin (LOEC).
